La génétique en pédiatrie

Du diagnostic syndromique aux grandes avancées technologiques

L’ADN (ou Acide DésoxyriboNucléique pour les intimes) est une macromolécule organisée en double-hélice qui est le support de l’information génétique d’un individu.

Le génome humain est composé de 46 chromosomes organisés en 23 paires.

Depuis la découverte de la structure de l’ADN en 1953 par Franklin, Watson et Crick, les technologies d’analyse n’ont jamais cessé d’évoluer à un rythme frénétique, à tel point qu’il peut être difficile d’être parfaitement au courant des informations qu’elles peuvent nous apporter ainsi que de leurs limites.

Cytogénétique

Historiquement plus ancienne que la génétique moléculaire, la cytogénétique s’intéresse au génome dans son ensemble et à l’architecture des chromosomes. Il s’agit d’une étude pangénomique mais qui a une résolution beaucoup plus faible que la génétique moléculaire.

On cherche une anomalie dans le nombre ou la structure des chromosomes. On n’étudie ici ni la séquence, ni les « mutations » des gènes.

Le caryotype
Le caryotype est la plus ancienne technique d’analyse du génome. Elle consiste à étudier des chromosomes métaphasiques (c’est à dire le stade de la mitose où ils sont condensés) après traitement faisant apparaître des bandes claires et sombres (« banding ») dont l’alternance est spécifique de chaque chromosome. Les autosomes (chromosomes non sexuels) ont été numérotés du plus grand au petit. On définit pour chaque chromosome un bras court « p » et un bras long « q » reliés au niveau du centromère.

Par exemple l’appellation 22q11.2 désigne : Sur le chromosome 22, le bras long, la 1e région, la 1e bande, la 2e sous-bande, elle ne doit donc pas être lue « vingt-deux q onze ».

Le caryotype permet de voir les variations de nombre (monosomie, trisomie, chromosome surnuméraire) et de structure (translocations réciproque et robertsonienne, inversions, insertions) d’une taille supérieure à 10 Mb, toute anomalie de plus petite taille ne sera pas vue.

Les variants de structure peuvent être « équilibrés », c’est-à-dire qu’il n’y pas de perte d’informations génétiques, seule l’organisation du génome est altérée.

Le caryotype précise également le caractère homogène (100 % des cellules analysées) ou mosaïque.

Ces anomalies de structure équilibrées sont classiquement bénignes pour l’individu puisqu’il n’y a pas de perte de matériel génétique. Des problèmes peuvent survenir dans la descendance de l’individu en fonction de la répartition des chromatides (on parle de ségrégation) qui peuvent éventuellement introduire un déséquilibre d’une anomalie équilibrée. Un individu porteur d’un remaniement équilibré peut toutefois être symptomatique si les points de cassure interrompent un gène, une région régulatrice, ou les éloigne…

Les autres variants de structure sont dits « déséquilibrés » : délétionnels ou duplicationnels. Une translocation équilibrée chez l’un des parents peut se déséquilibrer chez l’enfant s’il reçoit un chromosome normal et un dérivé de translocation : il aura alors une monosomie partielle et une trisomie partielle.

FISH
Une sonde de FISH est un fragment d’ADN de 100-150 kb, spécifique d’une région donnée et marqué par un fluorochrome. La sonde s’hybride avec sa région d’intérêt et génère un signal lumineux perceptible au microscope à fluorescence. Au final, il suffit de compter les signaux visualisés au microscope. La résolution est meilleure que le caryotype standard.

La FISH permet de mettre en évidence des anomalies beaucoup plus petites que ce qu’un caryotype standard est capable de voir mais elle implique de savoir ce que l’on cherche précisément.

Syndrome de Cornelia de Lange

• 1/50000, mode autosomique dominant, presque tous les cas sont sporadiques
• Atteintes des gènes impliqués dans la cohésion des chromosomes (complexe cohésine) :

» NIPBL (5p13.2) est muté chez environ 50 %

» Gène SMC1A (lié à l’X)

» Gène SMC3 (10q25)

• Microcéphalie
• Sourcils bien dessinés, arqués et confluents (synophrys)
• Cils longs
• Narines antéversées
• Bouche aux coins tombants
• Une lèvre supérieure très fine
• Micrognathie
• Hirsutisme
• Malformations des extrémités (mains fendues, oligodactylie)
• Déficience intellectuelle sévère, TED, trouble du comportement à type d’auto-aggressions
• Atteintes cardiaque (anomalies du septum)
• Dysfonction gastro-intestinales
• Troubles neurosensorielles (surdité)
• Cryptorchidie
• Anomalies rénales

FISH sur noyaux en haut et sur métaphase en bas. La sonde rouge cible la région 17p11.2. La sonde verte sert de contrôle sur le chromosome 17. Notez les 3 signaux rouges en haut et l’asymétrie des deux signaux rouges en bas provoqués par une duplication de la région 17p11.2 signant le syndrome de Potocki-Lupski.

Une FISH est souvent réalisée pour confirmer un résultat de CGH array.

Syndrome de Smith-Magenis

• 1/20000, mode autosomique dominant

• Gène RAI1
• Délétion 17p11.2 (90 %) emportant le gène
• Mutation pathogène intragénique (10 %)
• Brachycéphalie
• Visage large et carré
• Front bombant
• Léger hypertélorisme
• Synophrys
• Fentes palpébrales obliques en haut et en Dehors
• Hypoplasie de l’étage moyen de la face
• Racine du nez aplatie
• Éversion de la lèvre supérieure avec un aspect en chapeau de gendarme
• Micrognathie chez le nourrisson
• Surpoids une obésité du tronc fréquents chez l’adolescent et l’adulte
• Déficience intellectuelle
• Troubles du sommeil (cycle circadien inversé)
• Troubles du comportement fréquents : stéréotypies et des autoagression (onychotyllomanie et polyemboilokomanie)
• Parfois, anomalies dentaires et squelettiques des doigts, des vertèbres, persistance des pads foetaux digitaux
• Troubles neurosensorielles

Attention, le diagnostic influe sur la prise en charge ; notamment, les troubles du sommeil peuvent être traités par un blocage de la sécrétion diurne de mélatonine par des bêtabloquants, associés à une substitution de sa sécrétion diurne

CGH array
La CGH array (Comparative Genomique Hybridization array), aussi appelée ACPA (Analyse Chromosomique Puce à ADN) est une technique d’analyse quantitative. Elle visualise uniquement les gains et les pertes de matériel, dits les Copy Number Variations (CNV).

Une lame de CGH (ou « puce ») a une forme rectangulaire et comporte plusieurs milliers de « puits ». Au fond de chaque puits est fixée une séquence précise d’ADN spécifique d’une région chromosomique donnée.

L’ADN d’un patient est marqué par un fluorochrome (vert par exemple), l’ADN d’un témoin est marqué par un autre fluorochrome (rouge par exemple). Les ADN vont aller s’hybrider avec leur région complémentaire dans le puit correspondant. Un lecteur optique mesure le rapport de fluorescence de chaque puit. S’il y a un surplus d’hybridation d’ADN du patient, cela signifie qu’il est porteur d’un excès de la région concernée (3 copies, 4 copies, etc. en fonction de l’intensité du rapport de fluorescence), s’il y a un excès d’hybridation du témoin, cela signifie que le patient est porteur d’une perte (délétion homo ou hétérozygote) de la région concernée.

Syndrome de l’X fragile

• 1/4000, autosomique dominant , avec expansion des triplets de génération en génération (anticipation)
• Inhibition de la transcription du gène FMR1 (Xq27. 3), causée par l’expansion de la répétition de triplets (CGG)n dans sa région 5’ non traduite et les méthylations qui s’en suivent

• Mutation complète : > 200 répétitions de CGG
• Visage étroit et allongé
• Oreilles larges
• Front et mâchoire proéminents
• Macro-orchidie postpubertaire
• Hyperlaxité des doigts
• Pieds plats
• RGO
• Hypotonie
• Epilepsie
• Strabisme
• SAOS
• Retard des acquisitions motrices et/ou du langage
• Tro ubles du compor tement, TED (5 0 % - 70 %)
• Prémutation (55 à 200 triplets) peut conduire à une insuffisance ovarienne précoce (FXPOI) chez les femmes, et au syndrome tremblement-ataxie lié une prémutatiode l’X fragile (FXTAS) ; à rechercher dans la famille

Attention, en fonction de la résolution de la CGH, un CNV de petite taille peut passer inaperçu. Une analyse FISH ultérieure est souvent réalisée chez l’enfant et ses parents pour confirmer le CNV retrouvé et préciser le mécanisme (hérité, de novo, conséquence d’un remaniement équilibré chez un des parents), ce qui influence le conseil génétique (risque ou non de récurrence, …).

La CGH a permis de mettre en évidence de nombreux réarrangements chromosomiques qui étaient impossibles à voir en caryotype standard et a mené à la description de nombreux syndromes (micro) délétionnels et duplicationnels. De nos jours la CGH est l’examen de première intention en cas de déficit intellectuel, trouble du spectre autistique, malformations congénitales multiples, etc.

Le caryotype reste l’examen de première intention en cas de bilan d’hypofertilité d’un couple. L’hypothèse est celle d’un remaniement chromosomique équilibré chez l’un des parents qui entraînerait un déséquilibre lors de la méiose causant des fausses-couches à répétition.

Génétique moléculaire
A présent nous allons plus nous intéresser à la séquence même de l’ADN, l’alternance des nucléotides A, T, G, C.

Le séquençage Sanger
La technique classique de séquençage a été mise au point en 1977 et a valu son deuxième prix Nobel à son inventeur éponyme.

La technique nécessite de l’ADN à séquencer (présent en plusieurs exemplaires obtenus par PCR), une ADN polymérase, des amorces spécifiques du gène à séquencer, des nucléotides (ou désoxyribonucléotides ou dNTP puisqu’il s’agit d’ADN) en surnombre ainsi que des didésoxyribonucléotides (ddNTP) couplés à des fluorochromes, une couleur par base azotée.

Syndrome de Williams-Beuren

• 1/20000, généralement de novo, autosomique dominant
• Microdélétion des gènes contigus située dans la région 7q11.23, et qui comprend entre autres le gène ELN de l’élastine
• Mutations ponctuelles causant un phénotype avec dysmorphie et atteinte viscérale sans déficience intellectuelle
• Comblement sus-orbitaire
• Tâches de Brushfield iriens
• Petit nez, pointe ronde
• Philtrum long
• Grande bouche
• Petits dents espacées
• Lèvre inférieure charnue
• Petit menton
• Lobes d’oreilles proéminents
• Défaut des repères visuo-spatiaux contrastant
• Langage corre ct
• Comportement hypersociable, allant facilement vers les autres
• Déficience intellectuelle légère
• Hypersensibilité au bruit et dispositions pour la musique
• Hypoplasie de l’émail
• Strabisme et/ou des troubles de la réfraction dans 40 %
• Sténose aortique supra-valvulaire dans 75 % ; sténose des artères pulmonaires ou rénales, parfois responsable d’HTA réno-vasculaire
• Anomalies endocriniennes (hypercalcemie, hypothyroïdisme, puberté précoce)
• Diagnostic FISH en 1ère intention, qui fait le diagnostic dans 95 % des cas.

Le N désignant indifféremment une des 4 bases azotées A, T, C, G.  Un ddNTP est un dNTP altéré, il lui manque un groupement –OH en 3’ empêchant l’élongation du brin.

Lors de la synthèse du brin complémentaire, la polymérase incorpore le plus souvent un dNTP normal. Lorsqu’elle incorpore un ddNTP, elle ne peut plus allonger la chaîne nucléotidique.

Si la polymérase incorpore un ddATP en 10e position, on se retrouve avec un oligonucléotide de 10 nucléotides émettant de la fluorescence verte par exemple.

Le fait d’avoir un excès de nucléotides normaux par rapport aux ddNTP fait que ces derniers sont inclus de manière minoritaire et aléatoire.  Au bout d’un certain temps on se retrouve avec des fragments de toutes les tailles possibles. Il suffit de réaliser alors une électrophorèse et de « lire » l’alternance des couleurs pour connaître la séquence du gène. Chaque pic sur le chromatogramme correspondant à un nucléotide.

Cette technique séquence en même temps tous les allèles du gène et n’est pas quantitative. S’il y a au moins une position ou il y a deux pics différents, cela signifie que le patient possède deux allèles différents. S’il n’y a qu’un seul pic par position, cela signifie que le patient est homozygote (et possède donc 2 copies identiques) OU qu’il a une délétion d’un allèle.

Syndrome de Noonan

• 1 sur 2000 ; cas familiaux (transmission autosomique dominante) et des cas sporadiques (de novo)
• Mutations ponctuelles :
  • Gène PTPN11 (12q24.1) dans 50 % des cas, aboutissant un gain de fonction de la phosphotyrosine phosphatase SHP-2
  • SOS1 dans 13 % des cas du gène K-RAS (environ 5 %)
  • PTPN11 et K-RAS sont des partenaires dans la voie de signalisation RAS/MAPK
• Hypertélorisme, fentes palpébrales en bas et en dehors, ptosis
• Arc de cupidon accentué, oreilles basses implantées en rotation postérieure avec un hélix épais
• Pterygium colli, déformation de la cage thoracique et des mamelons anormalement écartées (situés en dehors de la ligne médioclaviculaire)
• Une sténose pulmonaire (20 % - 50 %)
• Cardiomyopathie hypertrophique (20 % - 30 %)
• Cryptorchidie
• Difficultés d’alimentation durant la petite enfance
• Tendance aux saignements, dysplasies lymphatiques
• Déficience intellectuelle légère, mais pouvant être inexistant
• Traitement par hormones de croissance parfois indiqué pour le retard de croissance

Autres techniques, hors NGS
Expansions de triplets : La technique de séquençage Sanger n’est pas fiable pour étudier les répétitions en tandem comme les expansions de triplet.

Par exemple, le syndrome de l’X fragile, la maladie de Huntington, ataxie de Friedreich, dystrophie myotonique de Steinert, différentes ataxies spino-cérebelleuses (SCA)…

Etude de l’empreinte parentale :
L’empreinte stipule qu’une région s’exprime différemment selon que le chromosome est d’origine maternelle ou paternelle. La maladie n’est pas provoquée par une anomalie de la séquence des gènes mais par des modifications épigénétiques, comprenant notamment la méthylation des cytosines des ilots CpG.

L’empreinte est une inactivation de la région. Par exemple, dire qu’un gène est soumis à empreinte paternelle signifie que le gène ne s’exprime pas chez l’allèle d’origine paternelle, seule la copie maternelle s’exprime. Ex : Syndromes de Prader-Willi (empreinte paternelle) et syndrome d’Angelman (empreinte maternelle).

Les phénomènes d’empreinte expliquent l’hérédité particulière de ces maladies. Une femme en bonne santé peut avoir un enfant atteint du syndrome d’Angelman si son père lui a transmis une délétion du gène causal (asymptomatique chez la mère, parce qu’habituellement non exprimé quand hérité du père).

La détermination de l’empreinte implique des études de la méthylation de l’ADN en premier lieu, puis d’autres techniques en cas de suspicion clinique forte.

Détail d’une peinture réalisée par William Kent (1685-1748), illustrant la cour du roi George le Ier, dont fait parti « Pierre de Hamelin ». Sa morphologie avec une énophtalmie, une proéminence de l’étage inférieur du visage, avec des lèvres épaisses et une macrostomie, des narines évasées, et l’histoire décrivant un enfant sans langage parlé, pourraient être rapportés à un syndrome de Pitt-Hopkins

Next Generation Sequencing, séquençage haut débit, massive parallel sequencing
Il s’agit de panels de gènes (panel épilepsie, panel anomalies du corps calleux, panel déficience intellectuelle), ou de séquençages pangénomiques (exome ou génome).

Définissons deux termes qui reviennent souvent dans le NGS :

• Profondeur : nombre de fois qu’une base, qu’un nucléotide est lu. Un exome à 30X signifie que l’on a séquencé tous les exons d’un individu et que chaque base a été lue en moyenne 30 fois.
• Couverture : le pourcentage de la région d’intérêt qui a été couvert par au moins une base. Je veux séquencer une séquence de 1000 nucléotides mais je n’ai récupéré qu’une séquence de 900 nucléotides. J’ai une couverture de 90 %.

Le principe du NGS est de réaliser des millions de réactions de séquençage en parallèle. L’ADN est préparé de différentes manières pour parvenir à avoir l’ADN à séquencer, lié à des adaptateurs permettant d’adhésion des enzymes et l’identification des patients.

Le principe du séquençage ressemble à peu près au séquençage Sanger décrit plus haut.

Le séquençage fonctionne par une succession de cycles d’incorporation des réactifs et de lavages.

A chaque fois qu’un nucléotide est incorporé, il émet un signal lumineux, une photo est prise. Un seul nucléotide ne peut être incorporé à chaque fois (sur chacun des millions de fragments subissant la réaction de séquençage) en raison du « terminator » qui empêche l’élongation. Puis il y a une étape de lavage, et une nouvelle introduction de réactifs, un autre nucléotide est incorporé, une autre photo est prise, etc. Cela en parallèle sur des millions d’échantillons.

A la fin, le séquenceur reconstitue la séquence à partir de toutes les photos prises.

Un fragment séquencé est appelé un « read » et il fait en moyenne 150 paires de bases. Des millions de reads chevauchant sont générés en parallèle et sont ensuite alignés sur un génome de référence.

Les grandes délétions ou insertions de plus de 300 kb sont encore mieux vus en CGH, sinon cette technique permet de voir les délétions, les insertions, les mosaïcismes, et les mutations ponctuelles.

Même si cette technique est puissante, se pose la question de l’interprétation des données. Un individu a en moyenne 30 000 variants par rapport à la séquence de référence sur un exome. Il peut être fastidieux de trouver la mutation causale du patient.

Chaque rectangle gris correspond à un read d’environ 150 bases qui a été placé sur le génome de référence. Les couleurs correspondent aux variations par rapport à la séquence de référence. Notez le chevauchement des reads. On définit la profondeur d’une base par le nombre de reads différents qui la portent.

A l’avenir, il est probable que la plupart des examens décrits ci-dessus viennent à disparaître, et soient remplacées par le whole genome sequencing. Se posent encore les problèmes des expansions de triplets (qui seront peut-être résolus par l’amélioration des polymérases) et de l’empreinte parentale (la technologie Oxford Nanopore est capable de différencier une cytosine méthylée d’une non méthylée).

J’espère que cet article vous aura plu et vous aura permis de comprendre un peu plus en détail les différents examens de génétiques, leurs performances et leurs limites.

J’espère simplement que les informations et explications fournies vous permettront de mieux appréhender les examens génétiques.

Partie technique : Romain NICOLLE, avec relecture par Lucie PIERRON
Internes en génétique médicale à Paris

Dessins et descriptions syndromiques : Lucas GAUTHIER
Interne en génétique médicale à Lyon

Illustrations techniques provenant du National Genome Research Institute
Article paru dans la revue “Association des Juniors en Pédiatrie” / AJP n°17